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色譜圖出現(xiàn)雙峰的原因和解決辦法分析
點(diǎn)擊: 次 時(shí)間:2016-11-26 11:16
高效液相色譜儀HPLC分析中,在色譜柱正常,樣品靈敏度足夠,分析方法合適,色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下(不包括梯度),峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是,在對樣品了解程度不夠,方法不妥,樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下,會出現(xiàn)各種意想不到的問題,本文主要說明色譜雙峰可能的原因及處理方法。
色譜雙峰可能的原因有三種。
1、色譜柱
如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)(出峰越快,雙峰的可能性會減少),尤其采用單一純物質(zhì)時(shí),可以肯定色譜柱出問題,柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。
如果進(jìn)樣量少,原來色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭受堵,將色譜柱反過來接,用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過來,一般情況下就行了。
當(dāng)然不反沖,正沖有時(shí)也會正常的。如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,這是可以將進(jìn)樣那頭擰開,將微孔濾片超聲,柱頭刮去一部分填料,重新填上新填料擰緊,不過這種活,需要一定技術(shù),同時(shí)不能老干那種事,否則用不了幾次,色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。
2、溶劑極性及進(jìn)樣量
許多HPLC分析者對此可能不以為然,一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容,而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜,流動相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。
樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解,但是很多情況是不一致的。
當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主,樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20ul,此條件下完全可以肯定,單一的純物質(zhì)出雙峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一樣),且拖尾,保留時(shí)間會提前(相對進(jìn)樣量少而言),將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎!_@是樣品的溶劑與流動相極性相差太大,而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。
上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因,另一個(gè)原因是,進(jìn)樣量不一定大,但絕對量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過大,色譜柱過載造成的。
3、樣品的特性
有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無法分開,而是以一個(gè)動態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí),在一個(gè)特定的條件下,一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現(xiàn)象將消失,如紅霉素等。
有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰,但在LC-MS下,用質(zhì)譜檢測器,其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯,例如農(nóng)藥啶蟲瞇(吡蟲清)。
(內(nèi)容來源儀器信息網(wǎng))
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