高效液相色譜、串聯質譜法檢測中藥材中有機磷農藥殘留量
點擊: 次 時間:2017-05-22 10:59
摘要:研究了中藥材中有機磷農藥殘留量的高效液相色譜..串聯質譜同步檢測方法。采用CAPCELLPAKMGC18反相柱,以乙腈為提取溶液,以Carb/PSA柱為凈化柱,液相色譜..串聯質譜儀測定。方法線性范圍為10~500..g/L,11種有機磷農藥在此范圍內線性良好,相關系數為0..9961~0..9999。在10~100..g/kg濃度范圍內,加標回收率在70%~110%之間,相對標準偏差為1..4%~11%,最低檢出限為2~20..g/kg,符合殘留檢測分析要求。
關鍵詞:高效液相色譜..串聯質譜;中藥材;有機磷農藥;多農藥殘留
有機磷農藥大量使用會在農作物中產生蓄積，作用,對人畜構成威脅,也會對環境產生負面影響。目前,我國中藥材中有機磷農藥殘留分析研究，較少[1~3],使用較多的檢測方法為氣相色譜法[4],，也有使用氣質聯用法[5],但較少使用液質聯用法。由于大多數中藥材成分復雜,對于復雜樣品多殘留痕量分析,氣相色譜和氣質連用抗干擾能力較差,對樣品前處理技術要求較高,而高效液相色譜..串聯質譜儀可以進行二級質譜分析,抗干擾能力較強,對前處理要求較低。通過選擇監測離子對一些成分復雜、背景較..臟..的樣品進行準確的定性和定量分析,比較適合中藥材中農藥多殘留檢測分析。本研究采用固相萃取凈化結合高效液相色譜.串聯質譜檢測的方法建立了梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花等中藥材中11種有機磷農藥的多殘。
檢測方法
1..實驗部分
1..儀器與材料
液相色譜..三重四極桿質譜聯用儀;粉粹機;臺式，離心機(最高轉速4500r/min);超聲波清洗器;氮氣吹干儀;旋轉蒸發儀;旋渦混合器;固相萃，取儀。甲醇和乙腈均為色譜純;甲苯、丙酮、無水硫酸，鈉為分析純;甲酸:純度>98%;活性炭;Carb/PSA雙層固相萃取柱(500mgCarb/500mgPSA/6mL)。標準品:敵敵畏;地蟲硫磷;殺撲磷;二嗪磷;甲基嘧啶磷;甲基谷硫磷;馬拉硫磷;毒死蜱;毒蟲畏;伏殺硫磷;乙硫磷。丙酮配制標準儲備溶液(100mg/L)。實驗藥材:梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花。
2..樣品提取
稱取粉碎、過0..45mm篩后的中藥材樣品5..0g于50mL塑料離心管中,加入30mL乙腈,加入5g無水硫酸鈉,蓋上蓋子,用手劇烈震蕩使其混合均勻,超聲30min,3500r/min離心5min,取15mL上清液于100mL梨形瓶中,35..下旋轉蒸發至干,待凈化。
3..樣品凈化
在Carb/PSA柱中加入0..5g活性炭,預先用4mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)活化小柱,用10mL
乙腈..甲苯(體積比為3:1)分三次溶解蒸干后殘過柱,收集流出液,用20mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)洗脫,收集流出液,合并流出液于平底燒中,35..下旋轉蒸發至0..5mL左右,氮氣吹干,用1mL乙腈溶解,過0..22..m濾膜后測定。
1..4..液相色譜條件
色譜柱:CAPCELLPAKMGC18柱(100mm.2..0mm.id.,3..m);柱溫:室溫;流速:200..L/min;進樣體積:10..L;流動相:V(0..1%甲酸水溶液):V(甲醇)=50:50,0~3min甲醇比例從50%線性增加至95%,然后保持4..5min,7..5~8min,線性恢復至初始流動相比例,然后平衡2min。
1..5..質譜分析條件
離子源:電噴霧離子化源(ESI);掃描模式:正離子模式;檢測方式:選擇反應檢測(SRM);電噴霧電壓:4000V;毛細管溫度:350..;碰撞氣:高純度氬氣;監測離子及對碰撞能量見表1。表1..ESI..MS/MS監測離子及對應碰撞能量有機磷農藥母離子
1..6..線性關系考察實驗準確吸取適量各農藥標準品儲備液,用空白品提取液在10~500..g/L范圍內稀釋成一系列不同濃度梯度,在選定的最佳液..質分離條件下進行測定,以樣品中各有機磷農藥的峰面積為縱坐標,含量(..g/L)為橫坐標,繪制標準曲線。
1..7..回收率和精密度實驗
稱取5種中藥材各5..0g,分別在10、50、100g/kg三個濃度下進行空白樣品加標實驗,分別按1..3中方法操作,每個濃度重復5次,測得平均回收率和精密度。
2、結果與討論
2..1..色譜條件..
液質聯用所用流動相中不能加入各種表面活性劑、難揮發鹽及其他對質譜響應有抑制作用的物質,流動相可選范圍較小,常用的為甲醇、乙腈、及其不同比例的混合物和一些易揮發性鹽的緩沖液。本研究考察了甲醇..水溶液流動相體系,實驗過程中加入適量的乙酸銨和甲酸,實驗結果表明,在甲醇..水溶液中加入0..1%的甲酸有助于有機磷農藥的離子化,響應值高。同時為了進一步改善峰形,縮短分析時間,采用了梯度洗脫,11種有機磷農藥均在7min之內出峰,峰形良好,詳見圖1。
2..2..質譜條件..
在ESI正離子模式下,所有物質均有良好響應,可同時觀察到其準分子離子峰。在對準分子離子進行二次質譜優化時又得到其碎片離子及各自的碰撞能量,選擇碎片離子作為定性定量依據(見表1),保證了靈敏度和準確性。
2..3..樣品提取劑..
有機磷農藥具有一定極性,不同文獻報道的取溶劑有所不同,本實驗分別考察了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷和正己烷5種提取溶劑對11種有機磷農藥的提取效率,結果表明,乙腈和二氯甲烷提取效率較高,但二氯甲烷提取的共提物較多,雜質干擾大,因此實驗選擇乙腈作為提取溶劑。
2..4..凈化方式..
實驗分別選擇活性炭、C18、SAX、Carb/PSA固相萃取柱凈化,結果表明,Carb/PSA固相萃取柱的凈化效果較理想,而且可以保證11中有機磷農藥的回收率均在70%以上。對于色素含量高的樣品,在小柱中加入一定量的活性炭脫色效果更好。
2..5..線性關系和最低檢出限..
按1..6方法操作,結果表明,5種中藥材中11種有機磷農藥在10~500..g/L濃度范圍內線性關系良好,梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花中11種有機磷農藥的線性相關系數為0..9961~0..9999。在空白樣品中添加標準品做檢出限實驗,以信噪比大于3為依據,確立了方法的最低檢出限,五種中藥材中11種有機磷農藥的最低檢出限為2~20..g/kg,詳見表2。
2..6..回收率和精密度..
按1..7方法操作,測得平均回收率和精密度,結果表明:在10~100..g/kg濃度范圍內,梔子中11種有機磷農藥平均回收率為84..0%~104..7%,相對標準偏差為1..4%~9..4%;車前草中有機磷農藥平均回收率為71..6%~87..8%,相對標準偏差為2..7%~11%;玄參中有機磷農藥平均回收率為73%~110%,相對標準偏差為1..8%~7..8%;甘草中有機磷農藥平均回收率為70%~86..5%,相對標準偏差為3..3%~9..5%;金銀花中有機磷農藥平均回收率為72..5%~96..8%,相對平均偏差為2..2%~9..1%。
2..7..樣品檢測..
利用本文建立的方法對從6家藥材店買回的，梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花等28個樣品進行了檢測,均未檢出有機磷農藥,并將本方法用于出口牛蒡中有機磷農藥殘留量檢測,2009年共檢測牛蒡樣品284個,均未檢出有機磷農藥。
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關鍵詞:高效液相色譜..串聯質譜;中藥材;有機磷農藥;多農藥殘留
有機磷農藥大量使用會在農作物中產生蓄積，作用,對人畜構成威脅,也會對環境產生負面影響。目前,我國中藥材中有機磷農藥殘留分析研究，較少[1~3],使用較多的檢測方法為氣相色譜法[4],，也有使用氣質聯用法[5],但較少使用液質聯用法。由于大多數中藥材成分復雜,對于復雜樣品多殘留痕量分析,氣相色譜和氣質連用抗干擾能力較差,對樣品前處理技術要求較高,而高效液相色譜..串聯質譜儀可以進行二級質譜分析,抗干擾能力較強,對前處理要求較低。通過選擇監測離子對一些成分復雜、背景較..臟..的樣品進行準確的定性和定量分析,比較適合中藥材中農藥多殘留檢測分析。本研究采用固相萃取凈化結合高效液相色譜.串聯質譜檢測的方法建立了梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花等中藥材中11種有機磷農藥的多殘。
檢測方法
1..實驗部分
1..儀器與材料
液相色譜..三重四極桿質譜聯用儀;粉粹機;臺式，離心機(最高轉速4500r/min);超聲波清洗器;氮氣吹干儀;旋轉蒸發儀;旋渦混合器;固相萃，取儀。甲醇和乙腈均為色譜純;甲苯、丙酮、無水硫酸，鈉為分析純;甲酸:純度>98%;活性炭;Carb/PSA雙層固相萃取柱(500mgCarb/500mgPSA/6mL)。標準品:敵敵畏;地蟲硫磷;殺撲磷;二嗪磷;甲基嘧啶磷;甲基谷硫磷;馬拉硫磷;毒死蜱;毒蟲畏;伏殺硫磷;乙硫磷。丙酮配制標準儲備溶液(100mg/L)。實驗藥材:梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花。
2..樣品提取
稱取粉碎、過0..45mm篩后的中藥材樣品5..0g于50mL塑料離心管中,加入30mL乙腈,加入5g無水硫酸鈉,蓋上蓋子,用手劇烈震蕩使其混合均勻,超聲30min,3500r/min離心5min,取15mL上清液于100mL梨形瓶中,35..下旋轉蒸發至干,待凈化。
3..樣品凈化
在Carb/PSA柱中加入0..5g活性炭,預先用4mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)活化小柱,用10mL
乙腈..甲苯(體積比為3:1)分三次溶解蒸干后殘過柱,收集流出液,用20mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)洗脫,收集流出液,合并流出液于平底燒中,35..下旋轉蒸發至0..5mL左右,氮氣吹干,用1mL乙腈溶解,過0..22..m濾膜后測定。
1..4..液相色譜條件
色譜柱:CAPCELLPAKMGC18柱(100mm.2..0mm.id.,3..m);柱溫:室溫;流速:200..L/min;進樣體積:10..L;流動相:V(0..1%甲酸水溶液):V(甲醇)=50:50,0~3min甲醇比例從50%線性增加至95%,然后保持4..5min,7..5~8min,線性恢復至初始流動相比例,然后平衡2min。
1..5..質譜分析條件
離子源:電噴霧離子化源(ESI);掃描模式:正離子模式;檢測方式:選擇反應檢測(SRM);電噴霧電壓:4000V;毛細管溫度:350..;碰撞氣:高純度氬氣;監測離子及對碰撞能量見表1。表1..ESI..MS/MS監測離子及對應碰撞能量有機磷農藥母離子
1..6..線性關系考察實驗準確吸取適量各農藥標準品儲備液,用空白品提取液在10~500..g/L范圍內稀釋成一系列不同濃度梯度,在選定的最佳液..質分離條件下進行測定,以樣品中各有機磷農藥的峰面積為縱坐標,含量(..g/L)為橫坐標,繪制標準曲線。
1..7..回收率和精密度實驗
稱取5種中藥材各5..0g,分別在10、50、100g/kg三個濃度下進行空白樣品加標實驗,分別按1..3中方法操作,每個濃度重復5次,測得平均回收率和精密度。
2、結果與討論
2..1..色譜條件..
液質聯用所用流動相中不能加入各種表面活性劑、難揮發鹽及其他對質譜響應有抑制作用的物質,流動相可選范圍較小,常用的為甲醇、乙腈、及其不同比例的混合物和一些易揮發性鹽的緩沖液。本研究考察了甲醇..水溶液流動相體系,實驗過程中加入適量的乙酸銨和甲酸,實驗結果表明,在甲醇..水溶液中加入0..1%的甲酸有助于有機磷農藥的離子化,響應值高。同時為了進一步改善峰形,縮短分析時間,采用了梯度洗脫,11種有機磷農藥均在7min之內出峰,峰形良好,詳見圖1。
2..2..質譜條件..
在ESI正離子模式下,所有物質均有良好響應,可同時觀察到其準分子離子峰。在對準分子離子進行二次質譜優化時又得到其碎片離子及各自的碰撞能量,選擇碎片離子作為定性定量依據(見表1),保證了靈敏度和準確性。
2..3..樣品提取劑..
有機磷農藥具有一定極性,不同文獻報道的取溶劑有所不同,本實驗分別考察了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷和正己烷5種提取溶劑對11種有機磷農藥的提取效率,結果表明,乙腈和二氯甲烷提取效率較高,但二氯甲烷提取的共提物較多,雜質干擾大,因此實驗選擇乙腈作為提取溶劑。
2..4..凈化方式..
實驗分別選擇活性炭、C18、SAX、Carb/PSA固相萃取柱凈化,結果表明,Carb/PSA固相萃取柱的凈化效果較理想,而且可以保證11中有機磷農藥的回收率均在70%以上。對于色素含量高的樣品,在小柱中加入一定量的活性炭脫色效果更好。
2..5..線性關系和最低檢出限..
按1..6方法操作,結果表明,5種中藥材中11種有機磷農藥在10~500..g/L濃度范圍內線性關系良好,梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花中11種有機磷農藥的線性相關系數為0..9961~0..9999。在空白樣品中添加標準品做檢出限實驗,以信噪比大于3為依據,確立了方法的最低檢出限,五種中藥材中11種有機磷農藥的最低檢出限為2~20..g/kg,詳見表2。
2..6..回收率和精密度..
按1..7方法操作,測得平均回收率和精密度,結果表明:在10~100..g/kg濃度范圍內,梔子中11種有機磷農藥平均回收率為84..0%~104..7%,相對標準偏差為1..4%~9..4%;車前草中有機磷農藥平均回收率為71..6%~87..8%,相對標準偏差為2..7%~11%;玄參中有機磷農藥平均回收率為73%~110%,相對標準偏差為1..8%~7..8%;甘草中有機磷農藥平均回收率為70%~86..5%,相對標準偏差為3..3%~9..5%;金銀花中有機磷農藥平均回收率為72..5%~96..8%,相對平均偏差為2..2%~9..1%。
2..7..樣品檢測..
利用本文建立的方法對從6家藥材店買回的，梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花等28個樣品進行了檢測,均未檢出有機磷農藥,并將本方法用于出口牛蒡中有機磷農藥殘留量檢測,2009年共檢測牛蒡樣品284個,均未檢出有機磷農藥。
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