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微量分光光度計(jì)原理及應(yīng)用介紹
點(diǎn)擊: 次 時(shí)間:2017-06-19 11:31
微量分光光度計(jì)能夠快速準(zhǔn)確的定量檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)等溶液。具有使用方便、消耗樣品少(僅2μl)、不用預(yù)熱、能迅速清理殘留樣品、不需要比色皿或其它樣品定位裝置、樣品不需要稀釋等特點(diǎn),常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量,目前已成為眾多實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器。
工作原理
超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定的原理是根據(jù)朗伯-比爾(Lamber-Beer)定律,A=K·C·L 式中,A為吸光度;K為吸(消)光系數(shù);C為溶液的濃度;L為液層厚度。此公式說(shuō)明:在入射光一定時(shí),溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比。此式就是光的吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式,又叫朗伯-比爾定律。
核酸定量
核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量測(cè)定溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA以及RNA含量。這是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵,具有紫外吸收的特性,最大的吸收波長(zhǎng)在260nm,吸收波谷在230nm。
除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。
蛋白質(zhì)直接定量
這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。
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工作原理
超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定的原理是根據(jù)朗伯-比爾(Lamber-Beer)定律,A=K·C·L 式中,A為吸光度;K為吸(消)光系數(shù);C為溶液的濃度;L為液層厚度。此公式說(shuō)明:在入射光一定時(shí),溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比。此式就是光的吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式,又叫朗伯-比爾定律。
核酸定量
核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量測(cè)定溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA以及RNA含量。這是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵,具有紫外吸收的特性,最大的吸收波長(zhǎng)在260nm,吸收波谷在230nm。
除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。
蛋白質(zhì)直接定量
這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。
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