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高效液相色譜儀常用檢測(cè)器的種類(lèi)
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檢測(cè)器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測(cè)的信號(hào)，常用檢測(cè)器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光等。
1.紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器(ultraviolet-visible detector，UVD)
紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器(UVD)是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測(cè)器。其特點(diǎn)是靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，適用于梯度洗脫，對(duì)強(qiáng)吸收物質(zhì)檢測(cè)限可達(dá)1ng，檢測(cè)后不破壞樣品，可用于制備，并能與任何檢測(cè)器串聯(lián)使用。紫外可見(jiàn)檢測(cè)器的工作原理與結(jié)構(gòu)同一般分光光度計(jì)相似，實(shí)際上就是裝有流動(dòng)地的紫外可見(jiàn)光度計(jì)。
(1)紫外吸收檢測(cè)器
紫外吸收檢測(cè)器常用氘燈作光源，氘燈則發(fā)射出紫外-可見(jiàn)區(qū)范圍的連續(xù)波長(zhǎng)，并安裝一個(gè)光柵型單色器，其波長(zhǎng)選擇范圍寬(190nm～800nm)。它有兩個(gè)流通池，一個(gè)作參比，一個(gè)作測(cè)量用，光源發(fā)出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過(guò)純的均勻溶劑，則它們?cè)谧贤獠ㄩL(zhǎng)下幾乎無(wú)吸收，光電管上接受到的輻射強(qiáng)度相等，無(wú)信號(hào)輸出。當(dāng)組分進(jìn)入測(cè)量池時(shí)，吸收一定的紫外光，使兩光電管接受到的輻射強(qiáng)度不等，這時(shí)有信號(hào)輸出，輸出信號(hào)大小與組分濃度有關(guān)。
局限：流動(dòng)相的選擇受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶劑不能做流動(dòng)相，每種溶劑都有截止波長(zhǎng)，當(dāng)小于該截止波長(zhǎng)的紫外光通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)不能小于溶劑的截止波長(zhǎng)。
(2)光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiode array detector， PDAD)
也稱快速掃描紫外可見(jiàn)分光檢測(cè)器，是一種新型的光吸收式檢測(cè)器。它采用光電二極管陣列作為檢測(cè)元件，構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長(zhǎng)的光信號(hào)，然后對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到吸收值(A)是保留時(shí)間(tR)和波長(zhǎng)(l)函數(shù)的三維色譜光譜圖。由此可及時(shí)觀察與每一組分的色譜圖相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，從而迅速?zèng)Q定具有最佳選擇性和靈敏度的波長(zhǎng)。
單光束二極管陣列檢測(cè)器，光源發(fā)出的光先通過(guò)檢測(cè)池，透射光由全息光柵色散成多色光，射到陣列元件上，使所有波長(zhǎng)的光在接收器上同時(shí)被檢測(cè)。陣列式接收器上的光信號(hào)用電子學(xué)的方法快速掃描提取出來(lái)，每幅圖象僅需要10ms，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)色譜流出峰的速度，因此可隨峰掃描。
2。熒光檢測(cè)器(fluorescence detector， FD)
熒光檢測(cè)器是一種高靈敏度、有選擇性的檢測(cè)器，可檢測(cè)能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過(guò)化學(xué)衍生化生成熒光衍生物，再進(jìn)行熒光檢測(cè)。其最小檢測(cè)濃度可達(dá)0.1ng/ml，適用于痕量分析;一般情況下熒光檢測(cè)器的靈敏度比紫外檢測(cè)器約高2個(gè)數(shù)量級(jí)，但其線性范圍不如紫外檢測(cè)器寬。 近年來(lái)，采用激光作為熒光檢測(cè)器的光源而產(chǎn)生的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器極大地增強(qiáng)了熒光檢測(cè)的信噪比，因而具有很高的靈敏度，在痕量和超痕量分析中得到廣泛應(yīng)用。
3. 示差折光檢測(cè)器(differential refractive Index detector， RID)
示差折光檢測(cè)器是一種濃度型通用檢測(cè)器，對(duì)所有溶質(zhì)都有響應(yīng)，某些不能用選擇性檢測(cè)器檢測(cè)的組分，如高分子化合物、糖類(lèi)、脂肪烷烴等，可用示差檢測(cè)器檢測(cè)。示差檢測(cè)器是基于連續(xù)測(cè)定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來(lái)測(cè)定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會(huì)產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相的折光指數(shù)不同，就可被檢測(cè)，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢測(cè)器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。
4. 電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemical detector， ED)
電化學(xué)檢測(cè)器主要有安培、極譜、庫(kù)侖、電位、電導(dǎo)等檢測(cè)器，屬選擇性檢測(cè)器，可檢測(cè)具有電活性的化合物。目前它已在各種無(wú)機(jī)和有機(jī)陰陽(yáng)離子、生物組織和體液的代謝物、食品添加劑、環(huán)境污染物、生化制品、農(nóng)藥及醫(yī)藥等的測(cè)定中獲得了廣泛的應(yīng)用。其中，電導(dǎo)檢測(cè)器在離子色譜中應(yīng)用最多。
電化學(xué)檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)是：
①靈敏度高，最小檢測(cè)量～般為ng級(jí)，有目可達(dá)pg級(jí);
?、谶x擇性好，可測(cè)定大量非電活性物質(zhì)中極痕量的電活性物質(zhì);
③線性范圍寬，一般為4～5個(gè)數(shù)量級(jí);
?、茉O(shè)備簡(jiǎn)單，成本較低;
?、菀子谧詣?dòng)操作。
5. 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(Chemiluminescence detector， CD)
化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速、靈敏的新型檢測(cè)器，因其設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。其原理是基于某些物質(zhì)在常溫下進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)勢(shì)反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，就發(fā)射出光子。由于物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來(lái)自化學(xué)反應(yīng)，故叫作化學(xué)發(fā)光。當(dāng)分離組分從色譜柱中洗脫出來(lái)后，立即與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)發(fā)光試劑混合，引起化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)產(chǎn)生輻射，其光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度成正比。
這種檢測(cè)器不需要光源，也不需要復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，只要有恒流泵，將化學(xué)發(fā)光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過(guò)光電倍增管將光信號(hào)變成電信號(hào)，就可進(jìn)行檢測(cè)。這種檢測(cè)器的最小檢出量可達(dá)10-12g。
6.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(EvaporativeLight-scatteringDetector ， ELSD)
通用型檢測(cè)器，能檢測(cè)不含發(fā)色團(tuán)的化合物，如：碳水化合物、脂類(lèi)、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物(人參皂苷、黃芪甲苷)，并在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測(cè)未知化合物 。
不同于紫外和熒光檢測(cè)器，ELSD的響應(yīng)不依賴與樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，不受其官能團(tuán)的影響。敏度比示差折光檢測(cè)器高，對(duì)溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。
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1.紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器(ultraviolet-visible detector，UVD)
紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器(UVD)是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測(cè)器。其特點(diǎn)是靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，適用于梯度洗脫，對(duì)強(qiáng)吸收物質(zhì)檢測(cè)限可達(dá)1ng，檢測(cè)后不破壞樣品，可用于制備，并能與任何檢測(cè)器串聯(lián)使用。紫外可見(jiàn)檢測(cè)器的工作原理與結(jié)構(gòu)同一般分光光度計(jì)相似，實(shí)際上就是裝有流動(dòng)地的紫外可見(jiàn)光度計(jì)。
(1)紫外吸收檢測(cè)器
紫外吸收檢測(cè)器常用氘燈作光源，氘燈則發(fā)射出紫外-可見(jiàn)區(qū)范圍的連續(xù)波長(zhǎng)，并安裝一個(gè)光柵型單色器，其波長(zhǎng)選擇范圍寬(190nm～800nm)。它有兩個(gè)流通池，一個(gè)作參比，一個(gè)作測(cè)量用，光源發(fā)出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過(guò)純的均勻溶劑，則它們?cè)谧贤獠ㄩL(zhǎng)下幾乎無(wú)吸收，光電管上接受到的輻射強(qiáng)度相等，無(wú)信號(hào)輸出。當(dāng)組分進(jìn)入測(cè)量池時(shí)，吸收一定的紫外光，使兩光電管接受到的輻射強(qiáng)度不等，這時(shí)有信號(hào)輸出，輸出信號(hào)大小與組分濃度有關(guān)。
局限：流動(dòng)相的選擇受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶劑不能做流動(dòng)相，每種溶劑都有截止波長(zhǎng)，當(dāng)小于該截止波長(zhǎng)的紫外光通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)不能小于溶劑的截止波長(zhǎng)。
(2)光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiode array detector， PDAD)
也稱快速掃描紫外可見(jiàn)分光檢測(cè)器，是一種新型的光吸收式檢測(cè)器。它采用光電二極管陣列作為檢測(cè)元件，構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長(zhǎng)的光信號(hào)，然后對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到吸收值(A)是保留時(shí)間(tR)和波長(zhǎng)(l)函數(shù)的三維色譜光譜圖。由此可及時(shí)觀察與每一組分的色譜圖相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，從而迅速?zèng)Q定具有最佳選擇性和靈敏度的波長(zhǎng)。
單光束二極管陣列檢測(cè)器，光源發(fā)出的光先通過(guò)檢測(cè)池，透射光由全息光柵色散成多色光，射到陣列元件上，使所有波長(zhǎng)的光在接收器上同時(shí)被檢測(cè)。陣列式接收器上的光信號(hào)用電子學(xué)的方法快速掃描提取出來(lái)，每幅圖象僅需要10ms，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)色譜流出峰的速度，因此可隨峰掃描。
2。熒光檢測(cè)器(fluorescence detector， FD)
熒光檢測(cè)器是一種高靈敏度、有選擇性的檢測(cè)器，可檢測(cè)能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過(guò)化學(xué)衍生化生成熒光衍生物，再進(jìn)行熒光檢測(cè)。其最小檢測(cè)濃度可達(dá)0.1ng/ml，適用于痕量分析;一般情況下熒光檢測(cè)器的靈敏度比紫外檢測(cè)器約高2個(gè)數(shù)量級(jí)，但其線性范圍不如紫外檢測(cè)器寬。 近年來(lái)，采用激光作為熒光檢測(cè)器的光源而產(chǎn)生的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器極大地增強(qiáng)了熒光檢測(cè)的信噪比，因而具有很高的靈敏度，在痕量和超痕量分析中得到廣泛應(yīng)用。
3. 示差折光檢測(cè)器(differential refractive Index detector， RID)
示差折光檢測(cè)器是一種濃度型通用檢測(cè)器，對(duì)所有溶質(zhì)都有響應(yīng)，某些不能用選擇性檢測(cè)器檢測(cè)的組分，如高分子化合物、糖類(lèi)、脂肪烷烴等，可用示差檢測(cè)器檢測(cè)。示差檢測(cè)器是基于連續(xù)測(cè)定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來(lái)測(cè)定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會(huì)產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相的折光指數(shù)不同，就可被檢測(cè)，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢測(cè)器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。
4. 電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemical detector， ED)
電化學(xué)檢測(cè)器主要有安培、極譜、庫(kù)侖、電位、電導(dǎo)等檢測(cè)器，屬選擇性檢測(cè)器，可檢測(cè)具有電活性的化合物。目前它已在各種無(wú)機(jī)和有機(jī)陰陽(yáng)離子、生物組織和體液的代謝物、食品添加劑、環(huán)境污染物、生化制品、農(nóng)藥及醫(yī)藥等的測(cè)定中獲得了廣泛的應(yīng)用。其中，電導(dǎo)檢測(cè)器在離子色譜中應(yīng)用最多。
電化學(xué)檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)是：
①靈敏度高，最小檢測(cè)量～般為ng級(jí)，有目可達(dá)pg級(jí);
?、谶x擇性好，可測(cè)定大量非電活性物質(zhì)中極痕量的電活性物質(zhì);
③線性范圍寬，一般為4～5個(gè)數(shù)量級(jí);
?、茉O(shè)備簡(jiǎn)單，成本較低;
?、菀子谧詣?dòng)操作。
5. 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(Chemiluminescence detector， CD)
化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速、靈敏的新型檢測(cè)器，因其設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。其原理是基于某些物質(zhì)在常溫下進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)勢(shì)反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，就發(fā)射出光子。由于物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來(lái)自化學(xué)反應(yīng)，故叫作化學(xué)發(fā)光。當(dāng)分離組分從色譜柱中洗脫出來(lái)后，立即與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)發(fā)光試劑混合，引起化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)產(chǎn)生輻射，其光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度成正比。
這種檢測(cè)器不需要光源，也不需要復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，只要有恒流泵，將化學(xué)發(fā)光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過(guò)光電倍增管將光信號(hào)變成電信號(hào)，就可進(jìn)行檢測(cè)。這種檢測(cè)器的最小檢出量可達(dá)10-12g。
6.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(EvaporativeLight-scatteringDetector ， ELSD)
通用型檢測(cè)器，能檢測(cè)不含發(fā)色團(tuán)的化合物，如：碳水化合物、脂類(lèi)、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物(人參皂苷、黃芪甲苷)，并在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測(cè)未知化合物 。
不同于紫外和熒光檢測(cè)器，ELSD的響應(yīng)不依賴與樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，不受其官能團(tuán)的影響。敏度比示差折光檢測(cè)器高，對(duì)溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。
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