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液相色譜法測定水產(chǎn)品中磺胺類殘留量
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本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的液相色譜測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的測定，其它磺胺類藥物的測定可以參照本標(biāo)準(zhǔn)。
規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
原理
用乙酸乙酯提取，稀鹽酸反提取，正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相色譜柱分離，熒光檢測器檢測，磺胺5-甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)法定量。
試劑
本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑在磺胺類藥物出峰處應(yīng)無干擾峰，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水標(biāo)準(zhǔn)。
標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑，磺胺5-甲氧嘧啶，純度均大于98.0%。
丙酮：色譜純。
正己烷：色譜純。
乙酸乙酯：色譜純。
乙腈：色譜純。
甲醇：色譜純。
熒光胺：純度大于99.0%。
乙酸鈉：分析純。
冰乙酸：優(yōu)級純。
鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水并稀釋至1000mL。
乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取28.7g無水乙酸鈉溶于蒸餾水中，定容至100mL。
熒光胺溶液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加15mL丙酮，振搖至完全溶解，存放在暗處。現(xiàn)配現(xiàn)用。
標(biāo)準(zhǔn)儲備液：100mg/L，稱取標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個(gè)月。
混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：1mg/L，移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。
內(nèi)標(biāo)儲備液：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個(gè)月。
內(nèi)標(biāo)中間液：1mg/L，移取內(nèi)標(biāo)儲備液1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。
混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內(nèi)標(biāo)中間液100μL，用2mol/L鹽酸(4.10)稀釋至2mL，配成濃度分別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為0.05mg/L。
儀器與設(shè)備
液相色譜儀：配熒光檢測器。
電子天平：感量0.0001g。
電子天平：感量0.01g。
高速組織搗碎機(jī)。
均質(zhì)機(jī)。
離心機(jī)。
旋渦混勻器。
氮吹儀。
往復(fù)式振蕩器。
聚丙烯離心管：15mL、50mL。
容量瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。
玻璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。
巴斯德吸管。
色譜條件
色譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。
柱溫：45℃。
流動(dòng)相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500mL水中加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0配制成乙酸溶液。
流速：1mL/min
進(jìn)樣量：20μL。
激發(fā)波長：405nm。
發(fā)射波長：495nm。
步驟分析
樣品制備
從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機(jī)搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品，混勻，均分成兩份。裝入清潔容器，加封，標(biāo)明標(biāo)記。-18℃以下冷凍保存。
提取
將樣品解凍，稱取2.00g，置于50mL聚丙烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.16)100μL，用玻璃棒攪勻，再加乙酸乙酯10mL，均質(zhì)機(jī)14000rpm均質(zhì)1min，往復(fù)式振蕩器振動(dòng)10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮?dú)獯抵?mL。再向原離心管中加入乙酸乙酯10mL，旋渦混勻30s，振動(dòng)10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到原15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮?dú)獯抵?mL。然后在試管中加入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液，旋渦混勻1min，加蓋后振動(dòng)10min，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層，在余液中加入正己烷5mL，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用。
衍生
向樣品瓶中加入200μL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液或樣品提取液、200μL乙酸鈉溶液和80μL熒光胺溶液，旋渦混勻30s，20min后供液相色譜分析。
色譜分析
取衍生后的樣品提取液20μL進(jìn)樣，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。磺胺類藥物色譜分析圖參見附錄A。
工作曲線
稱取空白樣品2.00g，分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺胺殘留量分別為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，磺胺含量為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。
計(jì)算
用色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按下式計(jì)算樣品中磺胺殘留量：
式中：
X——樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg);
s——樣品溶液中磺胺峰面積，單位為counts;
s1——樣品溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，單位為counts;
S——標(biāo)準(zhǔn)溶液中磺胺峰面積，單位為counts;
S1——標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，單位為counts;
x——加標(biāo)樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)。
方法回收率
濃度范圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時(shí)，回收率見回收率表。
回收率表
名稱
回收率
磺胺嘧啶
88.0%～111.8%
磺胺甲基嘧啶
90.0%～110.8%
磺胺二甲基嘧啶
91.0%～110.1%
磺胺甲基異噁唑
107.0%～116.7%
方法檢出限
本方法檢出限為0.010mg/kg。
精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。
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規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
原理
用乙酸乙酯提取，稀鹽酸反提取，正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相色譜柱分離，熒光檢測器檢測，磺胺5-甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)法定量。
試劑
本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑在磺胺類藥物出峰處應(yīng)無干擾峰，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水標(biāo)準(zhǔn)。
標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑，磺胺5-甲氧嘧啶，純度均大于98.0%。
丙酮：色譜純。
正己烷：色譜純。
乙酸乙酯：色譜純。
乙腈：色譜純。
甲醇：色譜純。
熒光胺：純度大于99.0%。
乙酸鈉：分析純。
冰乙酸：優(yōu)級純。
鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水并稀釋至1000mL。
乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取28.7g無水乙酸鈉溶于蒸餾水中，定容至100mL。
熒光胺溶液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加15mL丙酮，振搖至完全溶解，存放在暗處。現(xiàn)配現(xiàn)用。
標(biāo)準(zhǔn)儲備液：100mg/L，稱取標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個(gè)月。
混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：1mg/L，移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。
內(nèi)標(biāo)儲備液：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個(gè)月。
內(nèi)標(biāo)中間液：1mg/L，移取內(nèi)標(biāo)儲備液1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。
混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內(nèi)標(biāo)中間液100μL，用2mol/L鹽酸(4.10)稀釋至2mL，配成濃度分別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為0.05mg/L。
儀器與設(shè)備
液相色譜儀：配熒光檢測器。
電子天平：感量0.0001g。
電子天平：感量0.01g。
高速組織搗碎機(jī)。
均質(zhì)機(jī)。
離心機(jī)。
旋渦混勻器。
氮吹儀。
往復(fù)式振蕩器。
聚丙烯離心管：15mL、50mL。
容量瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。
玻璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。
巴斯德吸管。
色譜條件
色譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。
柱溫：45℃。
流動(dòng)相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500mL水中加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0配制成乙酸溶液。
流速：1mL/min
進(jìn)樣量：20μL。
激發(fā)波長：405nm。
發(fā)射波長：495nm。
步驟分析
樣品制備
從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機(jī)搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品，混勻，均分成兩份。裝入清潔容器，加封，標(biāo)明標(biāo)記。-18℃以下冷凍保存。
提取
將樣品解凍，稱取2.00g，置于50mL聚丙烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.16)100μL，用玻璃棒攪勻，再加乙酸乙酯10mL，均質(zhì)機(jī)14000rpm均質(zhì)1min，往復(fù)式振蕩器振動(dòng)10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮?dú)獯抵?mL。再向原離心管中加入乙酸乙酯10mL，旋渦混勻30s，振動(dòng)10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到原15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮?dú)獯抵?mL。然后在試管中加入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液，旋渦混勻1min，加蓋后振動(dòng)10min，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層，在余液中加入正己烷5mL，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用。
衍生
向樣品瓶中加入200μL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液或樣品提取液、200μL乙酸鈉溶液和80μL熒光胺溶液，旋渦混勻30s，20min后供液相色譜分析。
色譜分析
取衍生后的樣品提取液20μL進(jìn)樣，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。磺胺類藥物色譜分析圖參見附錄A。
工作曲線
稱取空白樣品2.00g，分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺胺殘留量分別為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，磺胺含量為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。
計(jì)算
用色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按下式計(jì)算樣品中磺胺殘留量：
式中：
X——樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg);
s——樣品溶液中磺胺峰面積，單位為counts;
s1——樣品溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，單位為counts;
S——標(biāo)準(zhǔn)溶液中磺胺峰面積，單位為counts;
S1——標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，單位為counts;
x——加標(biāo)樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)。
方法回收率
濃度范圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時(shí)，回收率見回收率表。
回收率表
名稱
回收率
磺胺嘧啶
88.0%～111.8%
磺胺甲基嘧啶
90.0%～110.8%
磺胺二甲基嘧啶
91.0%～110.1%
磺胺甲基異噁唑
107.0%～116.7%
方法檢出限
本方法檢出限為0.010mg/kg。
精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。
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